8 skutečností, že většina lidí neví o DNA ze slin

Od spuštění tohoto blogu, Genetický Odkaz, v roce 2009 jsme publikovali četné články, rozhovory, technické informace a infografiky, aby sdílet to, co víme o DNA ze slin. Sliny jsou nejdostupnější bio-tekutinou lidského těla, ale po 7 letech jsme i nadále překvapeni, jak často slyšíme špatné vnímání tohoto robustního a snadno přístupného typu vzorku. Je čas dát záznam na DNA ze slin jednou provždy. Jste připraveni? Tady jsou 8 fakta o DNA ze slin, které většina lidí neví.

fakt # 1: DNA ve slinách je odvozena jak z bukálních epiteliálních buněk, tak z bílých krvinek.

možná vás překvapí, že skutečný zdroj genomové DNA ve slinách obklopuje mnoho zmatků. Překvapivě většina lidí předpokládá, že zdrojem DNA ve slinách jsou přísně bukální epiteliální buňky. Nicméně, studie ukazují, že až 74% DNA ve slinách pochází z bílých krvinek, které jsou vynikajícím zdrojem velkého množství vysoce kvalitní genomové DNA. Sliny, které poskytují prakticky stejné množství DNA na objem a stejnou kvalitu DNA jako krev, lze považovat za ekvivalentní krvi pro genetické aplikace.

fakt # 2: drtivá většina DNA ze slin je lidského původu.

Zatímco většina vědců přednost velké množství DNA, technologický pokrok v navazujících platforem nyní umožňují testování i malé množství DNA s upozorněním, že DNA je dostatečně kvalitní. Jak je uvedeno ve skutečnosti # 1, většina DNA ve slinách pochází z bílých krvinek. Lidské sliny však také obsahují bakterie. Při extrakci DNA ze slin se bakteriální DNA získává spolu s lidskou DNA. Při srovnání s jinými perorálními metody odběru vzorků, jako jsou bukální stěry nebo ústní vody, 2mL vzorek slin shromažďovány s Oragene výnosy přibližně 11% bakteriální DNA, podstatně nižší, než ústní voda na 66% a buněčných kartáčků na více než 88% bakteriální DNA.

Pokud jste pomocí slin shromažďovány s produktem, jako Oragene, můžete si být jisti, že většina DNA ze slin je lidského původu s velmi nízkou bakteriální obsah.

fakt # 3: DNA ze slin má vysokou čistotu, navzdory nízkým poměrům A260/A230.

Absorbance při 230 se používá k měření různých kontaminantů, jako jsou fenolové a fenolové sloučeniny, uhlohydráty a další organické látky. Vzorky slin obsahují velké množství sacharidů (z silně glykosylovaného proteinového mucinu). Zatímco protein je odstraněn během extrakce, malé množství tohoto uhlohydrátu zůstává pozadu. Sacharidy absorbují velmi silně při 230nm, takže i malé množství uhlohydrátů může výrazně nafouknout čtení 230, což vede ke špatnému poměru. Přítomnost těchto sacharidů nemá vliv na navazující aplikace a proto A260/A230 není užitečná metoda k posouzení vhodnosti pro následné využití DNA extrahované ze vzorků slin. Fenoly mohou být obavy; nicméně, tyto nejsou v Oragene a prepIT•L2P činidla, takže to není problém pro Oragene/vzorky slin.

pro přesné měření čistoty DNA extrahované ze slin je třeba vypočítat A260/A280. Poměr absorbance při 260 nm vs. 280 nm se běžně používá k posouzení kontaminace DNA proteinových roztoků, protože proteiny (zejména aromatické aminokyseliny) absorbují světlo při 280 nm. Při extrakci pomocí prepIT * L2P je medián poměru A260/A280 mezi 1,6-1,9. Tyto poměry jsou obvykle svědčící o vzorek DNA, který bude fungovat dobře na vašem následné aplikace vzhledem k tomu, že všechny ostatní QC metriky pass (vysoké molekulové hmotnosti na gel, přijatelné koncentrace fluorescenční základě kvantifikace metoda).

fakt # 4: sliny poskytují vysoké množství DNA s vysokou molekulovou hmotností.

při extrakci DNA ze vzorků Oragenu / slin se RNA společně čistí s DNA. RNA neovlivní vaše následné aplikace (včetně PCR, SNP genotypizace, WES nebo WGS) a může být odstraněna, ale ovlivní kvantifikaci DNA, pokud kvantifikuje pouze absorbancí. Při kvantifikaci pomocí absorbance (jako je Nanodrop) měříte celkové množství nukleových kyselin ve vzorku (RNA a DNA). Proto by množství DNA ve vzorku mohlo být nadhodnoceno a mohlo by vést ke snížení výkonu v důsledku nedostatečného zatížení DNA do vašeho testu. Kvantifikace založená na fluorescenci, jako je Picogreen nebo Qubit, poskytuje přesné měření DNA ve vzorku slin.

průměrný výtěžek DNA z 2 ml vzorek slin pomocí Oragene je 110 µg, když se čistí podle optimalizované Oragene protokolu pomocí prepIT•L2P a měří vysoce specifické Fluorescenční/Dnázy metoda. Pokud jde o molekulovou hmotnost, DNA z Oragenu / slin má velikost >23 kbp. Výtěžek DNA i molekulová hmotnost zůstanou po mnoho let při pokojové teplotě při shromažďování v chemii stabilizace Oragenu vysoké integrity.

fakt # 5: sliny mohou spolehlivě nahradit krev pro analýzu DNA.

odběr krve je často považován za zlatý standard kvality DNA a je zavedenou praxí napříč nemocnicemi, klinikami a laboratořemi po celém světě. Mnoho lidí však neví, že nahrazení krve slinami je osvědčenou možností pro analýzu genomové DNA.

sady pro sběr slin (Oragene)jsou navrženy tak, aby stabilizovaly DNA s vysokou molekulovou hmotností tím, že inhibují degradaci a zabraňují růstu bakterií. Většina z DNA získané s Oragene je > 23 kb v velikost fragmentu a množství bakterií má minimální praktický význam, protože drtivá většina je lidského původu (v průměru pouze 11.8% bakterií).

Více studií potvrzuje, DNA extrahované z Oragene/vzorky slin výsledek v DNA nejvyšší integrity, provádí ekvivalentně krve pro nejnáročnější aplikace včetně microarrays a sekvenování (targeted a celého genomu).

fakt # 6: DNA ze slin je vhodná pro sekvenování celého genomu (WGS).

jsme překvapeni, že stále slyšíme obavy z používání slin pro sekvenování a je čas tyto obavy jednou provždy odpočinout. Existuje mnoho vědeckých odkazů na sliny (oragene), které se úspěšně používají pro sekvenování v malých i velkých studiích. Například Dr. Cory McLean z 23andMe představil plakát, ve kterém popsal WGS 50 vzorků slin. Práce Dr. McLeana zaměřená na mutaci LRRK2 G2019S v kohortě Parkinsonovy choroby, doporučuji vám podívat se na jeho plakát. DNA extrahované z těchto archivovaných Oragene/vzorky slin byl sekvenován pomocí Illumina technologie, na střední hloubka 44.9 násobné krytí a na které se vztahuje 97.8 – 98.2% genomu. Po identifikaci variant v těchto vzorcích Dr McLean porovnání výsledků dat ze stejné kohorty, která již byla určena pomocí genotypizace pole a pozoroval 99.91 – 99.97% shoda, což naznačuje, že Oragene/vzorky slin poskytují konzistentní výsledky napříč různými technologickými platformami. Otázka, kterou mnozí vědci stále kladou, je: jaký dopad má bakteriální obsah slin na sekvenování? Jasně jsme prokázali, že při provádění sekvenování nemá bakteriální obsah žádný vliv na volání variant.

kromě toho, plakát nedávno představila Široké Ústavu uvedl:

„K dnešnímu dni, jsme seřazeny přes 1585 (Oragene) vzorky slin 30x pokrytí pomocí HiSeqX (Illumina)… Vzhledem k této zkušenosti, jsme si jisti, sekvenování vzorků od pacientů z (Oragene) slin může být nákladově efektivní a produkovat vysoce kvalitní výsledky výzkumu a klinických studií.“

Pokud jste váhala použít sliny pro sekvenování celého genomu, můžete si být jisti, že nyní je čas to zkusit.

fakt # 7: sběr DNA ze slin je levnější než DNA z krve.

cena spojená s odběr krve může být vnímána zdarma pro mnoho institucí, které mají zavedené odběr krve labs/service center; nicméně, tam jsou skutečné náklady na odběr vzorků i v těchto prostředích. Phlebotomists, zdravotnický materiál a přepravní požadavky (suchý led, kontejnery, a dodání přes noc) přidat odhadem $ 40 na vzorek, bez mrazáku skladování. DNA ze slin, shromážděná s produktem, jako je Oragene, ve srovnání, přichází v různých formátech s různými schopnostmi výnosu a stability, které stojí mezi 48% – 80% méně. Další úspory jsou zavedeny, protože produkty Oragene umožňují domácí sběr, standardní přepravu běžnou poštou při pokojové teplotě a nulové chlazení.

Daksis, J. I. et al. státy, „získání vysoce kvalitní DNA pro molekulární assay z ústní vzorků nabízí jasné výhody v nákladech, manipulace, skladování a doprava po získání vzorků z krve. … Proto otevírá cestu pro pohodlné testování místa péče … “

Abraham J. E et al. pokračuje “ … komerční extrakce DNA ze slin je levnější než z krve.“

a další studie Nishita, D. M. et al. zprávy “ získání krve biospecimens představuje logistické a finanční výzvy. Výsledkem je, že sběr biospecimen slin je stále častější kvůli snadnému sběru a nižším nákladům.“

celkově jsou sliny levnější než krev pro odběr DNA při zohlednění všech nákladů spojených s postupem odběru vzorků.

fakt # 8: metody odběru vzorků slin DNA nejsou všechny stejné.

existují 3 metody pro sběr vzorků orální DNA-suché, mokré a neinvazivní postupy. Suché postupy vyžadují, aby dárce vložil cytobrush, bukální tampon nebo jiné sběrné zařízení do úst, kde je tkáň oškrábána z povrchu dásní a tváří. Tyto metody shromažďují především bukální buňky a vysoký podíl bakterií, které se drží na dásně.

Nicméně, vzorky DNA získané ze slin, kde dárce plive do kolekce zařízení (Oragene) jsou zcela odlišné a nabízejí vyšší výnosy a kvality DNA než ostatní ústní DNA vzorku, metody sběru. Jedna studie, pod názvem Nové Slin DNA Metoda Sběru Oproti Bukální Buňky Sbírka Techniky pro Epidemiologické Studie, uvádí:

„Whole-sběr slin za předpokladu, průměr DNA výnos, který byl výrazně větší než všechny ostatní metody… Medián výtěžku … byl přibližně trojnásobek mediánu výtěžku perorálního máchání a více než 12násobek mediánu výtěžku pro bukální výtěr a kartáčové metody.“

je jasné, že NE všechny DNA slin metody jsou stejné, ale můžete si být jisti při výběru možnosti, jako Oragene, která optimalizuje kvalitu a množství DNA.

závěr

Jedná se o 8 faktů o DNA ve slinách, o kterých se domníváme, že mnoho lidí neví. Doufáme, že to pomůže vyčistit většinu dezinformací, které stále cirkulují o DNA ze slin. Pokud jste si v minulosti nevybrali DNA ze slin, měli byste nyní mít jistotu, že se rozhodnete pro jakékoli projekty zahrnující analýzu genomické DNA. Desítky tisíc vědců a lékařů po celém světě již pracují se slinami díky vysokému kvalitnímu výkonu spojenému s rychlým a snadným sběrem a efektivní přepravou. Nezapomeňte si vyžádat hodnotící sady pro další studii níže.

Thiede, C. et al. K získání otisků DNA před transplantací od příjemců alogenní transplantace kostní dřeně lze použít bukální výtěry, nikoli však vzorky ústní vody. (2000). Transplantace Kostní Dřeně. 25(5): 575-577.

obsah lidské genomové DNA ve vzorcích slin odebraných pomocí sady pro vlastní sběr oragene®, DNA Genotek white paper, PD-WP-011

Iwasiow, rm and Birnboim, HC (2006). Od zákalu k jasnosti: jednoduché metody ke zlepšení poměru a260/A280 vzorků DNA čištěných Oragene®. DNA Genotek. MK-AN-017

výtěžek DNA pomocí sady pro vlastní sběr ORAGENE®, DNA Genotek. PD-WP-001.

Iwasiow, R. M. a Birnboim, H. C. (2011). Dlouhodobá stabilita DNA ze vzorků slin uložených v Samosběrné sadě oragene®. DNA Genotek. PD-WP-005,

McLean et al, Whole-genome sequencing 50 LRRK2 G2019S dopravci nesouhlasný k léčbě Parkinsonovy choroby,

Dodge S, Ferriera S, Philippakis, Farjoun Y, E Banky, Barry, Wilkinson J, Cabili M, Sutherland S, Siedzik D, De Smet T, Gabriel. S. Sekvenování Celých Genomů s DNA Odvozené od Slin. Poster session prezentováno na: 2016 Advances in Genome Biology and Technology Meeting (AGBT); 2016 Únor 10-13; Orlando, FL.

Ambrosone C.B. et al. Provádění molekulárního epidemiologického výzkumu ve věku HIPAA: Multiinstitucionální případová kontrolní studie rakoviny prsu u afroamerických a Evropsko-amerických žen. J Oncol. 2009: 1-15 (2009).

Daksis J. I. a Erikson G. H. Heteropolymerní Triplex-Based Genomic Assay® k detekci patogenů nebo Jednonukleotidových polymorfismů v lidských genomických vzorcích. PLoS jedna. 2(3): e305 (2007).

Abraham, J.E. et al. (2012). Vzorky slin jsou životaschopnou alternativou ke vzorkům krve jako zdroj DNA pro vysoce výkonnou genotypizaci.

Nishita D.M. et al. Charakteristiky účastníků klinického hodnocení a metriky slin a DNA. Metoda BMC Med Res. 9(71): 1-20 (2009).

Rogers n.L. et al. Nová metoda sběru dna slin ve srovnání s technikami sběru bukálních buněk pro epidemiologické studie. Am J Hum Biol. 19:319–326 (2007).

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *