8 faits la plupart des gens ne connaissent pas l’ADN de la salive

Depuis le lancement de ce blog, The Genetic Link, en 2009, nous avons publié de nombreux articles, interviews, informations techniques et infographies pour partager ce que nous savons sur l’ADN de la salive. La salive est le bio-fluide le plus accessible du corps humain, mais, après 7 ans, nous continuons d’être surpris de la fréquence à laquelle nous entendons des perceptions erronées sur ce type d’échantillon robuste et facile d’accès. Il est temps de remettre les pendules à l’heure sur l’ADN de la salive une fois pour toutes. Prêts? Voici 8 faits sur l’ADN de la salive que la plupart des gens ne connaissent pas.

Fait #1: L’ADN dans la salive est dérivé à la fois des cellules épithéliales buccales et des globules blancs.

Il pourrait vous surprendre de savoir que beaucoup de confusion entoure la véritable source d’ADN génomique dans la salive. Étonnamment, la plupart des gens supposent que la source d’ADN dans la salive est strictement des cellules épithéliales buccales. Cependant, des études montrent que jusqu’à 74% de l’ADN contenu dans la salive provient de globules blancs qui sont une excellente source de grandes quantités d’ADN génomique de haute qualité. Produisant pratiquement la même quantité d’ADN par volume et la même qualité d’ADN que le sang, la salive peut être considérée comme équivalente au sang pour des applications génétiques.

Fait #2: La grande majorité de l’ADN de la salive est d’origine humaine.

Alors que la plupart des scientifiques préfèrent de grandes quantités d’ADN, les avancées technologiques dans les plates-formes en aval permettent désormais de tester même de petites quantités d’ADN avec la mise en garde que l’ADN est de qualité suffisante. Comme indiqué en fait #1, la majorité de l’ADN dans la salive provient de globules blancs. Cependant, la salive humaine contient également des bactéries. Lors de l’extraction de l’ADN de la salive, l’ADN bactérien est récupéré avec l’ADN humain. Par rapport à d’autres méthodes d’échantillonnage par voie orale, telles que les écouvillons buccaux ou les bains de bouche, un échantillon de salive de 2 ml prélevé avec de l’Oragène donne environ 11% d’ADN bactérien, nettement inférieur au bain de bouche à 66% et aux cytobrushes à plus de 88% d’ADN bactérien.

Si vous utilisez de la salive collectée avec un produit comme Oragene, vous pouvez être sûr que la majorité de l’ADN de la salive est d’origine humaine avec une très faible teneur en bactéries.

Fait #3:L’ADN de la salive est d’une grande pureté, malgré de faibles rapports A260/A230.

L’absorbance à 230 est utilisée pour mesurer divers contaminants tels que le phénol et les composés phénoliques, les glucides et d’autres composés organiques. Les échantillons de salive contiennent une grande quantité de glucides (de la mucine protéique fortement glycosylée). Alors que les protéines sont éliminées lors de l’extraction, de petites quantités de ce glucide sont laissées. Les glucides absorbent très fortement à 230 nm, de sorte que même de petites quantités de glucides peuvent gonfler considérablement la lecture de 230, ce qui conduit à un rapport médiocre. La présence de ces hydrates de carbone n’affecte pas l’application en aval et, par conséquent, A260 / A230 n’est pas une méthode utile pour évaluer l’aptitude à l’utilisation en aval de l’ADN extrait d’échantillons de salive. Les composés phénoliques peuvent être préoccupants; cependant, ceux-ci ne se trouvent pas dans les réactifs Oragène et prepIT • L2P, ce n’est donc pas un problème pour les échantillons d’oragène / salive.

Pour mesurer avec précision la pureté de l’ADN extrait de la salive, il faut calculer A260/A280. Le rapport d’absorbance à 260 nm vs 280 nm est couramment utilisé pour évaluer la contamination de l’ADN des solutions protéiques, car les protéines (en particulier les acides aminés aromatiques) absorbent la lumière à 280 nm. Lors de l’extraction avec prepIT • L2P, le rapport médian A260 / A280 est compris entre 1,6 et 1,9. Ces rapports sont généralement indicatifs d’un échantillon d’ADN qui fonctionnera bien sur votre application en aval étant donné que toutes vos autres métriques de QC passent (poids moléculaire élevé sur gel, concentrations acceptables par méthode de quantification à base de fluorescence).

Fait #4: La salive produit de l’ADN de poids moléculaire élevé en grande quantité.

Lors de l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons d’Oragène / salive, l’ARN va co-purifier avec l’ADN. L’ARN n’affectera pas vos applications en aval (y compris la PCR, le génotypage SNP, le WES ou le WGS) et peut être éliminé, mais il affectera la quantification de l’ADN s’il ne se quantifie que par absorbance. Lors de la quantification par absorbance (comme le Nanodrop), vous mesurez la quantité totale d’acides nucléiques dans un échantillon (ARN et ADN). Par conséquent, la quantité d’ADN dans un échantillon pourrait être surestimée et pourrait entraîner une réduction des performances en raison de la sous-charge d’ADN dans votre test. La quantification basée sur la fluorescence telle que Picogreen ou Qubit fournit une mesure précise de l’ADN dans un échantillon de salive.

Le rendement médian en ADN d’un échantillon de salive de 2 ml utilisant l’Oragène est de 110 µg lorsqu’il est purifié selon le protocole Oragène optimisé utilisant le prepIT•L2P et mesuré par la méthode très spécifique de Fluorescence/DNase. En termes de poids moléculaire, l’ADN de l’Oragène /de la salive a une taille > de 23 kbp. Le rendement en ADN et le poids moléculaire resteront intègres pendant des années à température ambiante lorsqu’ils seront collectés dans la chimie de stabilisation de l’oragène.

Fait #5: La salive peut remplacer de manière fiable le sang pour l’analyse de l’ADN.

La collecte de sang est souvent considérée comme la norme d’or pour la qualité de l’ADN et c’est une pratique établie dans les hôpitaux, les cliniques et les laboratoires du monde entier. Cependant, beaucoup de gens ne savent pas que le remplacement du sang par de la salive est une option éprouvée pour l’analyse de l’ADN génomique.

Les kits de collecte de salive (Oragene) sont conçus pour stabiliser l’ADN de haut poids moléculaire en inhibant la dégradation et en empêchant la croissance bactérienne. La majorité de l’ADN obtenu avec l’Oragène a une taille de fragment > de 23 ko et la quantité de bactéries a une signification pratique minimale car la grande majorité est d’origine humaine (en moyenne seulement 11,8% de bactéries).

Plusieurs études confirment que l’ADN extrait d’échantillons d’Oragène / salive donne un ADN de la plus haute intégrité, performant de manière équivalente au sang pour les applications les plus exigeantes, y compris les puces et le séquençage (génome ciblé et entier).

Fait #6:L’ADN de la salive convient au séquençage du génome entier (WGS).

Nous sommes surpris que nous continuions à entendre des préoccupations concernant l’utilisation de la salive pour le séquençage et il est temps de mettre fin à ces craintes une fois pour toutes. Il existe de nombreuses références scientifiques pour la salive (Oragène) utilisée avec succès pour le séquençage dans de petites et de grandes études. Par exemple, le Dr Cory McLean de 23andMe a présenté une affiche dans laquelle il décrivait des GT de 50 échantillons de salive. Les travaux du Dr McLean se sont concentrés sur la mutation LRRK2 G2019S dans une cohorte de la maladie de Parkinson, je vous encourage à jeter un coup d’œil à son affiche. L’ADN extrait de ces échantillons d’Oragène/salive archivés a été séquencé, à l’aide de la technologie Illumina, à une profondeur médiane de couverture de 44,9 fois et couvrait 97,8 à 98,2% du génome. Après avoir identifié les variantes dans ces échantillons, le Dr McLean a comparé les résultats aux données de la même cohorte précédemment déterminées à l’aide d’une matrice de génotypage et a observé une concordance de 99,91 à 99,97%, indiquant que les échantillons d’Oragène et de salive fournissent des résultats cohérents sur différentes plateformes technologiques. La question que de nombreux chercheurs continuent de poser est: quel est l’impact du contenu bactérien de la salive sur le séquençage? Nous avons clairement démontré que lors du séquençage, le contenu bactérien n’a aucun impact sur l’appel de variantes.

En outre, une affiche récemment présentée par le Broad Institute indiquait:

« À ce jour, nous avons séquencé plus de 1585 échantillons de salive (Oragene) à une couverture 30x en utilisant le HiSeqX (Illumina) Given Compte tenu de cette expérience, nous sommes convaincus que le séquençage d’échantillons de patients à partir de salive (Oragene) peut être rentable et produire des résultats de haute qualité pour la recherche et les études cliniques.”

Si vous avez hésité à utiliser la salive pour le séquençage du génome entier, vous pouvez être sûr qu’il est maintenant temps d’essayer.

Fait #7: La collecte d’ADN à partir de la salive est moins coûteuse que l’ADN à partir du sang.

Le prix associé à la collecte de sang peut être perçu comme gratuit pour de nombreuses institutions qui ont établi des laboratoires / centres de service de collecte de sang; cependant, la collecte d’échantillons entraîne des coûts réels, même dans ces environnements. Les phlébotomistes, les fournitures médicales et les exigences d’expédition (glace carbonique, contenants et livraison de nuit) ajoutent environ 40 $ par échantillon, sans compter l’entreposage au congélateur. L’ADN de la salive, collecté avec un produit comme l’Oragène, en comparaison, est disponible dans une variété de formats avec des capacités de rendement et de stabilité différentes qui coûtent entre 48% et 80% de moins. Les produits Oragene permettent une collecte à domicile, une expédition standard par courrier ordinaire à température ambiante et une réfrigération nulle.

Daksis, J.I. et al. « L’acquisition d’ADN de haute qualité pour le dosage moléculaire à partir d’échantillons oraux offre des avantages évidents en termes de coût, de manipulation, de stockage et d’expédition par rapport à l’acquisition d’échantillons de sang. Abraham Cela ouvre donc la voie à des tests pratiques au point de service

Abraham J.E et al. continue  » extraction l’extraction commerciale de l’ADN de la salive est moins chère que celle du sang. »

Et une autre étude de Nishita, D.M. et al. rapports  » L’obtention de biospécimens sanguins présente des défis logistiques et financiers. En conséquence, la collecte de biospécimen de salive devient de plus en plus fréquente en raison de la facilité de collecte et du coût inférieur.”

Dans l’ensemble, la salive est moins chère que le sang pour la collecte de l’ADN si l’on tient compte de tous les coûts associés à la procédure de collecte des échantillons.

Fait #8: Les méthodes de prélèvement d’échantillons de salive d’ADN ne sont PAS toutes égales.

Il existe 3 méthodes de collecte d’échantillons d’ADN par voie orale – procédures sèches, humides et non invasives. Les procédures sèches exigent que le donneur insère un cytobrush, un écouvillon buccal ou un autre dispositif de collecte dans la bouche où le tissu est gratté de la surface des gencives et des joues. Ces méthodes recueillent principalement des cellules buccales et une forte proportion de bactéries qui adhèrent à la gencive.

Cependant, les échantillons d’ADN prélevés dans la salive où le donneur crache dans un dispositif de collecte (Oragene) sont très différents et offrent des rendements et une qualité d’ADN plus élevés que les autres méthodes de collecte d’échantillons d’ADN par voie orale. Une étude, intitulée New Salive DNA Collection Method Compared to Buccal Cell Collection Techniques for Epidemiological Studies, déclare:

« La collecte de salive entière a fourni un rendement moyen en ADN significativement supérieur à toutes les autres méthodes… Le rendement médian was était environ trois fois le rendement médian du rinçage buccal et plus de 12 fois le rendement médian des méthodes d’écouvillon buccal et de brosse. »

Il est clair que toutes les méthodes de salive d’ADN ne sont pas égales, mais vous pouvez être confiant lorsque vous choisissez une option comme Oragene qui optimise à la fois la qualité et la quantité d’ADN.

Conclusion

Voici les 8 faits sur l’ADN dans la salive que nous croyons que beaucoup de gens ne connaissent pas. Nous espérons que cela aidera à éclaircir une grande partie de la désinformation qui continue de circuler sur l’ADN de la salive. Si vous n’avez pas choisi l’ADN de la salive dans le passé, vous devriez maintenant avoir confiance en ce choix pour tout projet impliquant une analyse de l’ADN génomique. Des dizaines de milliers de chercheurs et de cliniciens du monde entier travaillent déjà avec la salive en raison de ses performances de haute qualité associées à une collecte rapide et facile et à un transport efficace. Assurez-vous de demander des trousses d’évaluation pour votre prochaine étude ci-dessous.

Thiede, C. et al. Des écouvillons buccaux, mais pas des échantillons de rince-bouche, peuvent être utilisés pour obtenir des empreintes ADN pré-transplantation de receveurs d’une greffe de moelle osseuse allogénique. (2000). Greffe de Moelle Osseuse. 25(5): 575-577.

Contenu d’ADN génomique humain d’échantillons de salive collectés avec le kit d’auto-collecte Oragene®, Livre blanc DNA Genotek, PD-WP-011

Iwasiow, R.M. et Birnboim, H.C. (2006). De la turbidité à la clarté : Des méthodes simples pour améliorer le rapport A260/A280 des échantillons d’ADN purifiés par Oragene®. ADN Génotek. MK-AN-017

Rendement en ADN avec un kit d’auto-collecte Oragene®, DNA Genotek. PD-WP-001.

Iwasiow, R.M. et Birnboim, H.C. (2011). Stabilité à long terme de l’ADN des échantillons de salive stockés dans le kit d’auto-collecte Oragene®. ADN Génotek. PD-WP-005

McLean et al, Séquençage du génome entier de 50 porteurs LRRK2 G2019 discordants pour la maladie de Parkinson,

Dodge S, Ferriera S, Philippakis A, Farjoun Y, Banks E, Barry A, Wilkinson J, Cabili M, Sutherland S, Siedzik D, De Smet T, Gabriel S. Séquençage de Génomes entiers avec de l’ADN dérivé de la Salive. Session d’affiches présentée à: Réunion sur les progrès de la Biologie et de la Technologie du Génome 2016 (AGBT); 10-13 février 2016; Orlando, FL.

Ambrosone C.B. et al. Mener des recherches épidémiologiques moléculaires à l’ère de l’HIPAA: Une Étude Cas-Témoins Multi-Institutionnelle du Cancer du sein chez les femmes Afro-Américaines et Européennes-Américaines. J Oncol. 2009: 1-15 (2009).

Daksis J.I. et Erikson G.H. Heteropolymeric Triplex-Based Genomic Assay® pour détecter des Agents pathogènes ou des Polymorphismes mononucléotidiques dans des échantillons génomiques humains. PLoS UN. 2(3): e305 (2007).

Abraham, J.E. et coll. (2012). Les échantillons de salive sont une alternative viable aux échantillons de sang comme source d’ADN pour le génotypage à haut débit.

Nishita D.M. et coll. Caractéristiques des participants à l’essai clinique et mesures de la salive et de l’ADN. Méthode BMC Med Res. 9(71): 1-20 (2009).

Rogers N.L. et coll. New Salive DNA Collection Method Compared to Buccal Cell Collection Techniques for Epidemiological Studies. J’ai Fredonné Biol. 19:319–326 (2007).

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