8 fatti la maggior parte delle persone non conosce il DNA dalla saliva

Dal lancio di questo blog, The Genetic Link, nel 2009, abbiamo pubblicato numerosi articoli, interviste, informazioni tecniche e infografiche per condividere ciò che sappiamo sul DNA dalla saliva. La saliva è il bio-fluido più accessibile del corpo umano ma, dopo 7 anni, continuiamo ad essere sorpresi di quanto spesso sentiamo percezioni sbagliate su questo tipo di campione robusto e di facile accesso. E ‘ il momento di mettere le cose in chiaro sul DNA dalla saliva una volta per tutte. Sei pronto? Ecco 8 fatti sul DNA dalla saliva che la maggior parte delle persone non conosce.

Fatto # 1: il DNA nella saliva deriva sia dalle cellule epiteliali buccali che dai globuli bianchi.

Potrebbe sorprenderti sapere che molta confusione circonda la vera fonte del DNA genomico nella saliva. Sorprendentemente, la maggior parte delle persone assume che la fonte del DNA nella saliva sia strettamente buccale cellule epiteliali. Tuttavia, gli studi dimostrano che fino al 74% del DNA nella saliva proviene da globuli bianchi che sono un’ottima fonte di grandi quantità di DNA genomico di alta qualità. Producendo praticamente la stessa quantità di DNA per volume e la stessa qualità del DNA del sangue, la saliva può essere considerata equivalente al sangue per applicazioni genetiche.

Fatto # 2: La stragrande maggioranza del DNA dalla saliva è di origine umana.

Mentre la maggior parte degli scienziati preferisce grandi quantità di DNA, i progressi tecnologici nelle piattaforme a valle ora consentono di testare anche piccole quantità di DNA con l’avvertenza che il DNA è di qualità sufficiente. Come dichiarato infatti # 1, la maggior parte del DNA nella saliva proviene da globuli bianchi. Tuttavia, la saliva umana contiene anche batteri. Quando si estrae il DNA dalla saliva, il DNA batterico viene recuperato insieme al DNA umano. Rispetto ad altri metodi di campionamento orale, come tamponi buccali o collutorio, un campione di saliva da 2 ml raccolto con Oragene produce circa l ‘11% di DNA batterico, sostanzialmente inferiore al collutorio al 66% e cytobrushes a oltre l’ 88% di DNA batterico.

Se si utilizza la saliva raccolta con un prodotto come Oragene, si può essere certi che la maggior parte del DNA dalla saliva è di origine umana con un contenuto batterico molto basso.

Fatto # 3: il DNA della saliva è di elevata purezza, nonostante i bassi rapporti A260 / A230.

L’assorbanza a 230 viene utilizzata per misurare vari contaminanti come fenolo e composti fenolici, carboidrati e altri prodotti organici. I campioni di saliva contengono una grande quantità di carboidrati (dalla mucina proteica fortemente glicosilata). Mentre la proteina viene rimossa durante l’estrazione, piccole quantità di questo carboidrato vengono lasciate indietro. I carboidrati assorbono molto fortemente a 230nm quindi anche piccole quantità di carboidrati possono gonfiare notevolmente la lettura 230 portando ad un rapporto povero. La presenza di questi carboidrati non influisce sull’applicazione a valle e pertanto A260/A230 non è un metodo utile per valutare l’idoneità all’uso a valle del DNA estratto da campioni di saliva. I fenolici possono essere di preoccupazione; tuttavia, questi non sono all’interno dei reagenti Oragene e prepIT•L2P, quindi questo non è un problema per i campioni di Oragene/saliva.

Per misurare con precisione la purezza del DNA estratto dalla saliva, è necessario calcolare A260/A280. Il rapporto di assorbanza a 260 nm vs 280 nm è comunemente usato per valutare la contaminazione del DNA delle soluzioni proteiche, poiché le proteine (in particolare gli amminoacidi aromatici) assorbono la luce a 280 nm. Quando si estrae con prepIT * L2P, il rapporto mediano A260 / A280 è compreso tra 1,6-1,9. Questi rapporti sono in genere indicativi di un campione di DNA che funzionerà bene sull’applicazione a valle dato che passano tutte le altre metriche QC (alto peso molecolare su gel, concentrazioni accettabili con metodo di quantificazione basato su fluorescenza).

Fatto # 4: La saliva produce alta quantità di DNA ad alto peso molecolare.

Quando si estrae il DNA da campioni di Oragene / saliva, l’RNA si co-purifica con il DNA. L’RNA non influenzerà le applicazioni a valle (tra cui PCR, genotipizzazione SNP, WES o WGS) e può essere rimosso, tuttavia influenzerà la quantificazione del DNA se quantifica solo l’assorbanza. Quando si quantifica per assorbanza (come Nanodrop) si misura la quantità totale di acidi nucleici in un campione (RNA e DNA). Pertanto, la quantità di DNA in un campione potrebbe essere sopravvalutata e potrebbe comportare prestazioni ridotte a causa del sotto-carico di DNA nel test. La quantificazione basata sulla fluorescenza come Picogreen o Qubit fornisce una misurazione accurata del DNA all’interno di un campione di saliva.

La resa mediana del DNA da un campione di saliva da 2 ml utilizzando Oragene è di 110 µg quando purificata secondo il protocollo Oragene ottimizzato utilizzando prepIT•L2P e misurata con il metodo di fluorescenza/DNasi altamente specifico. In termini di peso molecolare, il DNA di Oragene / saliva è di dimensioni >23 kbp. Sia la resa del DNA che il peso molecolare rimarranno di alta integrità per anni a temperatura ambiente quando raccolti nella chimica di stabilizzazione di Oragene.

Fatto # 5: la saliva può sostituire in modo affidabile il sangue per l’analisi del DNA.

La raccolta del sangue è spesso considerata lo standard d’oro per la qualità del DNA ed è una pratica consolidata in ospedali, cliniche e laboratori in tutto il mondo. Tuttavia, molte persone non sanno che sostituire il sangue con la saliva è un’opzione comprovata per l’analisi del DNA genomico.

I kit di raccolta della saliva (Oragene) sono progettati per stabilizzare il DNA ad alto peso molecolare inibendo la degradazione e prevenendo la crescita batterica. La maggior parte del DNA ottenuto con Oragene è > 23kb nella dimensione del frammento e la quantità di batteri ha un significato pratico minimo in quanto la stragrande maggioranza è di origine umana (in media solo l ‘ 11,8% di batteri).

Studi multipli confermano che il DNA estratto da campioni di Oragene / saliva risulta in DNA della massima integrità, eseguendo in modo equivalente al sangue per le applicazioni più impegnative tra cui microarray e sequenziamento (genoma mirato e intero).

Fatto # 6: il DNA della saliva è adatto per il sequenziamento dell’intero genoma (WGS).

Siamo sorpresi che continuiamo a sentire preoccupazioni circa l’utilizzo di saliva per il sequenziamento ed è il momento di mettere quelle paure a riposo una volta per tutte. Ci sono molti riferimenti scientifici per la saliva (Oragene) utilizzata con successo per il sequenziamento in studi sia piccoli che grandi. Ad esempio, il Dr. Cory McLean di 23andMe ha presentato un poster in cui ha descritto WGS di campioni di saliva 50. Il lavoro del Dr. McLean si è concentrato sulla mutazione LRRK2 G2019S in una coorte di malattia di Parkinson, ti incoraggio a dare un’occhiata al suo poster. Il DNA estratto da questi campioni di Oragene/saliva archiviati è stato sequenziato, utilizzando la tecnologia Illumina, ad una profondità mediana di 44,9 volte la copertura e coperto 97,8 – 98,2% del genoma. Dopo aver identificato le varianti in questi campioni, il Dr. McLean ha confrontato i risultati con i dati della stessa coorte precedentemente determinata utilizzando una matrice di genotipizzazione e ha osservato una concordanza del 99,91 – 99,97%, indicando che i campioni di Oragene/saliva forniscono risultati coerenti su diverse piattaforme tecnologiche. La domanda che molti ricercatori continuano a chiedere è: che impatto ha il contenuto batterico della saliva sul sequenziamento? Abbiamo chiaramente dimostrato che quando si esegue il sequenziamento il contenuto batterico non ha alcun impatto sulla chiamata variante.

In aggiunta, un poster, recentemente presentato dal Broad Institute ha dichiarato:

“Ad oggi, abbiamo sequenziato oltre 1585 (Oragene) dei campioni di saliva a 30x copertura utilizzando il HiSeqX (Illumina)… Dato questa esperienza, siamo sicuri che il sequenziamento del paziente campioni (Oragene) saliva può essere efficace e produrre risultati di alta qualità per le attività di ricerca e studi clinici.”

Se sei stato riluttante a usare la saliva per il sequenziamento dell’intero genoma, puoi essere sicuro che è giunto il momento di provarlo.

Fatto # 7: Raccogliere il DNA dalla saliva è meno costoso del DNA dal sangue.

Il prezzo associato alla raccolta del sangue può essere percepito come gratuito per molte istituzioni che hanno stabilito laboratori di raccolta del sangue/centri di assistenza; tuttavia, ci sono costi reali per la raccolta del campione anche all’interno di questi ambienti. I flebotomisti, le forniture mediche e i requisiti di spedizione (ghiaccio secco, contenitori e consegna durante la notte) aggiungono una stima di 4 40 per campione, escluso lo stoccaggio del congelatore. Il DNA dalla saliva, raccolto con un prodotto come Oragene, in confronto, è disponibile in una varietà di formati con diverse capacità di resa e stabilità che costano tra il 48% e l ‘ 80% in meno. Ulteriori risparmi vengono introdotti poiché i prodotti Oragene consentono la raccolta a casa, la spedizione standard tramite posta ordinaria a temperatura ambiente e la refrigerazione zero.

Daksis, J. I. et al. afferma: “L’acquisizione di DNA di alta qualità per il test molecolare da campioni orali offre chiari vantaggi in termini di costi, manipolazione, conservazione e spedizione rispetto all’acquisizione di campioni dal sangue. opens Apre quindi la strada a un comodo test point of care testing ”

Abraham J. E et al. continua ” extraction l’estrazione commerciale del DNA dalla saliva è più economica che dal sangue.”

E un altro studio di Nishita, D. M. et al. rapporti ” Ottenere sangue biospecimens presenta sfide logistiche e finanziarie. Di conseguenza, la raccolta di saliva biospecimen sta diventando più frequente a causa della facilità di raccolta e del costo inferiore.”

Nel complesso, la saliva è meno costosa del sangue per la raccolta del DNA quando tiene conto di tutti i costi associati alla procedura di raccolta del campione.

Fatto # 8: i metodi di raccolta del campione di saliva del DNA NON sono tutti uguali.

Esistono 3 metodi per la raccolta di campioni di DNA orale: procedure asciutte, bagnate e non invasive. Le procedure asciutte richiedono al donatore di inserire un citobrush, un tampone buccale o un altro dispositivo di raccolta nella bocca dove il tessuto viene raschiato dalle superfici gengivali e delle guance. Questi metodi raccolgono principalmente cellule buccali e un’alta percentuale di batteri che si attaccano al margine gengivale.

Tuttavia, i campioni di DNA raccolti dalla saliva in cui il donatore sputa in un dispositivo di raccolta (Oragene) sono molto diversi e offrono rese e qualità del DNA più elevate rispetto ad altri metodi di raccolta del campione di DNA orale. Uno studio, intitolato New Saliva DNA Collection Method Compared to Buccal Cell Collection Techniques for Epidemiological Studies, afferma:

” La raccolta di tutta la saliva ha fornito una resa media del DNA significativamente maggiore di tutti gli altri metodi… La resa mediana … era circa tre volte la resa mediana del risciacquo orale e più di 12 volte la resa mediana per i metodi tampone e pennello buccale.”

È chiaro che NON tutti i metodi di saliva del DNA sono uguali, ma puoi essere sicuro quando scegli un’opzione come Oragene che ottimizza sia la qualità che la quantità di DNA.

Conclusione

Questi sono gli 8 fatti sul DNA nella saliva che crediamo molte persone non conoscono. Speriamo che questo aiuti a chiarire gran parte della disinformazione che continua a circolare sul DNA dalla saliva. Se non hai scelto il DNA dalla saliva in passato, ora dovresti sentirti sicuro di fare quella scelta per qualsiasi progetto che coinvolga l’analisi del DNA genomico. Decine di migliaia di ricercatori e medici in tutto il mondo stanno già lavorando con la saliva grazie alle sue prestazioni di alta qualità abbinate alla raccolta rapida e facile e al trasporto efficiente. Assicurati di richiedere kit di valutazione per il tuo prossimo studio qui sotto.

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Resa del DNA con un kit di auto-raccolta Oragene®, DNA Genotek. PD-WP-001.

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