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Controlli FMO

Fluorescenza meno uno (FMO) controlli sono campioni colorati con tutti i fluorofori nel pannello, meno uno di loro. Sono utilizzati per impostare il limite superiore per il segnale di fondo sull’etichetta omessa, e quindi per identificare e gate popolazioni positive in esperimenti multicolor. Gli FMO sono cruciali quando i positivi non sono chiaramente separati dai negativi a causa del livello di espressione basso o variabile (la popolazione è debole o uno striscio). Si raccomanda generalmente di includere FMO per ogni marcatore durante il test e l’ottimizzazione di un nuovo pannello anticorpale multicolore. Una volta che il pannello è correttamente convalidato, alcuni degli FMO potrebbero essere eliminati e solo quelli per le popolazioni difficili da gate vengono successivamente eseguiti con ogni lotto di campioni completamente macchiati.

Gli FMO sono controlli di gating più accurati rispetto ai campioni non colorati o colorati singoli perché tengono conto dell’allargamento delle popolazioni negative a causa della diffusione dello spillover (vedi controlli di compensazione). Tuttavia, gli FMO non controllano il legame anticorpale aspecifico (vedere blocco Fc e titolazione Ab) o il livello di espressione basale non trascurabile (vedere controlli biologici). È importante sottolineare che i controlli FMO sono influenzati sia dall’autofluorescenza che dai livelli di espressione dei marcatori secondari nelle cellule e quindi devono essere dello stesso tipo di cellule rispetto ai campioni sperimentali e non possono essere sostituiti da perline o da una linea cellulare irrilevante.

FMO

Fig. 1. Le popolazioni negative PE mostrano una maggiore diffusione dei dati nel pannello multicolore e richiedono un controllo FMO per un accurato gating delle popolazioni positive.

Ulteriori informazioni:
  • Bio-Rad Cytometry Basics Guide: Fluorescent Minus One Controls
  • FMO articolo a BiteSizeBio

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