8 feiten de meeste mensen weten niets over DNA uit speeksel

sinds de lancering van deze blog, the Genetic Link, in 2009, hebben we talrijke artikelen, interviews, technische informatie en infographics gepubliceerd om te delen wat we weten over DNA uit speeksel. Speeksel is de meest toegankelijke bio-vloeistof van het menselijk lichaam, maar na 7 jaar blijven we verbaasd over hoe vaak we verkeerde percepties horen over dit robuuste en gemakkelijk toegankelijke monstertype. Het is tijd om het DNA van speeksel eens en voor altijd recht te zetten. Ben je klaar? Hier zijn 8 feiten over DNA van speeksel dat de meeste mensen niet weten.

feit # 1: DNA in speeksel is afgeleid van zowel buccale epitheelcellen als witte bloedcellen.

Het kan u verbazen dat er veel verwarring heerst over de echte bron van genomisch DNA in speeksel. Verrassend genoeg nemen de meeste mensen aan dat de bron van DNA in speeksel strikt buccale epitheliale cellen is. Studies tonen echter aan dat tot 74% van het DNA in speeksel afkomstig is van witte bloedcellen die een uitstekende bron zijn van grote hoeveelheden genomisch DNA van hoge kwaliteit. Het leveren van vrijwel dezelfde hoeveelheid DNA per volume en dezelfde DNA-kwaliteit als bloed, speeksel kan worden beschouwd als gelijkwaardig aan bloed voor genetische toepassingen.

feit # 2: het overgrote deel van DNA uit speeksel is van menselijke oorsprong.hoewel de meeste wetenschappers de voorkeur geven aan grote hoeveelheden DNA, maken technologische vooruitgang in downstream platforms het nu mogelijk om zelfs kleine hoeveelheden DNA te testen, met het voorbehoud dat het DNA van voldoende kwaliteit is. Zoals in feite # 1, de meerderheid van DNA in speeksel komt uit witte bloedcellen. Echter, menselijk speeksel bevat ook bacteriën. Bij het extraheren van DNA uit speeksel, wordt bacterieel DNA teruggevonden samen met het menselijke DNA. In vergelijking met andere orale bemonsteringsmethoden, zoals buccale swabs of mondwater, levert een 2 ml speekselmonster verzameld met Oragene ongeveer 11% bacterieel DNA op, aanzienlijk lager dan mondwater bij 66% en cytobrushes bij meer dan 88% bacterieel DNA.

Als u speeksel gebruikt dat is verzameld met een product als Oragene, kunt u er zeker van zijn dat het merendeel van het DNA uit speeksel van menselijke oorsprong is met een zeer laag bacterieel gehalte.

feit # 3: DNA uit speeksel is van hoge zuiverheid, ondanks lage A260 / A230-verhoudingen.

absorptie bij 230 wordt gebruikt om verschillende contaminanten zoals fenol en fenolverbindingen, koolhydraten en andere organische stoffen te meten. Speekselmonsters bevatten een grote hoeveelheid koolhydraten (uit het sterk geglycosyleerde eiwit mucine). Terwijl eiwit wordt verwijderd tijdens de extractie, blijft kleine hoeveelheden van dit koolhydraat achter. De koolhydraten absorberen zeer sterk bij 230nm zodat zelfs kleine hoeveelheden koolhydraten de 230 lezing zeer kunnen opblazen die tot een slechte verhouding leiden. De aanwezigheid van deze koolhydraten heeft geen invloed op de downstream-toepassing en daarom is A260/A230 geen nuttige methode om de geschiktheid voor downstream-gebruik van DNA uit speekselmonsters te beoordelen. Fenolics kan van zorg zijn; echter, deze zijn niet binnen Oragene en prepIT•L2P reagentia, dus dit is geen probleem voor oragene / speeksel monsters.

om de zuiverheid van uit speeksel geëxtraheerd DNA nauwkeurig te meten, moet A260/A280 worden berekend. De verhouding van absorptie bij 260 nm Versus 280 nm wordt algemeen gebruikt om de besmetting van DNA van eiwitoplossingen te beoordelen, aangezien de proteã nen (in het bijzonder, de aromatische aminozuren) licht bij 280 nm absorberen. Bij het extraheren met prepIT * L2P ligt de mediane A260/A280 verhouding tussen 1,6-1,9. Deze verhoudingen zijn typisch indicatief van een DNA-steekproef die goed op uw downstreamtoepassing zal presteren aangezien al uw andere QC metrics overgaan (hoog molecuulgewicht op gel, aanvaardbare concentraties door fluorescente gebaseerde kwantificeringsmethode).

feit # 4: speeksel levert DNA met een hoog molecuulgewicht op.

bij het extraheren van DNA uit Orageen/speeksel monsters zal RNA Co-zuiveren met DNA. Het RNA zal uw downstreamtoepassingen (met inbegrip van PCR, SNP Genotyping, WES, of WGS) niet beà nvloeden en kan worden verwijderd, nochtans zal het kwantificering van het DNA beà nvloeden indien het slechts door absorptie kwantificeert. Bij het kwantificeren door absorptie (zoals Nanodrop) meet je de totale hoeveelheid nucleïnezuren in een monster (RNA en DNA). Daarom kan de hoeveelheid DNA in een monster worden overschat en kan resulteren in verminderde prestaties als gevolg van de onderbelasting van DNA in uw assay. De kwantificering die op fluorescentie zoals Picogreen of Qubit wordt gebaseerd verstrekt een nauwkeurige meting van DNA binnen een speekselsteekproef.

de mediane opbrengst van DNA uit een 2 ml speekselmonster met Oragene is 110 µg wanneer gezuiverd volgens het geoptimaliseerde oragene protocol met prepIT * L2P en gemeten met de zeer specifieke fluorescentie / DNase methode. In termen van Molecuulgewicht is DNA uit Orageen/speeksel >23 kbp groot. Zowel de DNA-opbrengst als het molecuulgewicht blijven jarenlang van hoge integriteit bij kamertemperatuur wanneer ze worden verzameld in de Oragene stabilisatiechemie.

feit # 5: speeksel kan op betrouwbare wijze bloed vervangen voor DNA-analyse.

bloedinzameling wordt vaak beschouwd als de gouden standaard voor DNA-kwaliteit en het is een gevestigde praktijk in ziekenhuizen, klinieken en laboratoria wereldwijd. Nochtans, weten veel mensen niet dat het vervangen van bloed met speeksel een bewezen optie voor genomic DNA analyse is.

Speekselverzamelingskits (Oragene) zijn ontworpen om DNA met een hoog moleculair gewicht te stabiliseren door afbraak te remmen en bacteriegroei te voorkomen. De meerderheid van het met Oragene verkregen DNA is > 23kb in fragmentgrootte en de hoeveelheid bacteriën heeft een minimale praktische betekenis aangezien de overgrote meerderheid van menselijke oorsprong is (gemiddeld slechts 11,8% bacteriën).

meerdere studies bevestigen dat DNA dat uit Orageen/speekselmonsters is geëxtraheerd, resulteert in DNA met de hoogste integriteit, dat gelijkwaardig is aan bloed voor de meest veeleisende toepassingen, waaronder microarrays en sequencing (gericht en volledig genoom).

feit # 6: DNA uit speeksel is geschikt voor whole genome sequencing (WGS).

Het verbaast ons dat we zorgen blijven horen over het gebruik van speeksel voor sequencing en het is tijd om die angst voor eens en voor altijd te laten rusten. Er zijn vele wetenschappelijke verwijzingen voor speeksel (Oragene) die met succes voor het rangschikken in zowel kleine als grote studies worden gebruikt. Bijvoorbeeld, Dr. Cory McLean van 23andMe presenteerde een poster waarin hij WGS van 50 speekselmonsters beschreef. Dr. McLean ‘ s werk richtte zich op de LRRK2 G2019S mutatie in een Parkinson cohort, ik moedig u aan om een kijkje te nemen op zijn poster. Het DNA dat uit deze gearchiveerde Oragene/speekselsteekproeven wordt gehaald werd gerangschikt, gebruikend Illumina – technologie, aan een mediane diepte van 44,9 vouwendekking en behandelde 97,8-98,2% van het genoom. Na het identificeren van de varianten in deze monsters vergeleek Dr.McLean de resultaten met gegevens van dezelfde cohort eerder bepaald met behulp van een genotyping array en observeerde een 99,91 – 99,97% concordantie, wat aangeeft dat Oragene/speeksel monsters consistente resultaten bieden over verschillende technologie platforms. De vraag die veel onderzoekers blijven stellen is: welke impact heeft bacteriële inhoud van speeksel op sequencing? We hebben duidelijk aangetoond dat bij het uitvoeren van sequencing de bacteriële inhoud heeft geen invloed op variant bellen.

bovendien heeft een poster onlangs gepresenteerd door het Brede Instituut verklaard:

“tot op heden hebben we meer dan 1585 (Oragene) speeksel monsters gesequenced tot 30x dekking met behulp van de HiSeqX (Illumina)… gezien deze ervaring, zijn we ervan overtuigd dat sequencing patiënt monsters van (Oragene) speeksel kan kosteneffectief zijn en hoge kwaliteit resultaten voor onderzoek en klinische studies.”

Als u aarzelde om speeksel te gebruiken voor het sequencen van het hele genoom, kunt u er zeker van zijn dat het nu tijd is om het eens te proberen.feit # 7: Het verzamelen van DNA uit speeksel is goedkoper dan DNA uit bloed.

de prijs die gepaard gaat met het inzamelen van bloed kan worden beschouwd als gratis voor veel instellingen die bloedinzamelingslaboratoria/ – servicecentra hebben opgericht; er zijn echter reële kosten voor het inzamelen van monsters, zelfs binnen deze omgevingen. Flebotomisten, medische benodigdheden en de scheepvaart eisen (droogijs, containers, en ‘ s nachts levering) voeg een geschatte $40 per monster, exclusief vriezer opslag. DNA uit speeksel, verzameld met een product als Oragene, in vergelijking, komt in een verscheidenheid van formaten met verschillende opbrengst en stabiliteit mogelijkheden die tussen 48% – 80% minder kosten. Meer besparingen worden geà ntroduceerd omdat Oragene producten thuis kunnen worden opgehaald, Standaard Verzending via de reguliere Post bij kamertemperatuur en nulkoeling mogelijk maken.

Daksis, J. I. et al. Staten, ” de verwerving van DNA van hoge kwaliteit voor moleculaire assay van orale Monsters biedt duidelijke voordelen in kosten, behandeling, opslag en verzending over de verwerving van monsters uit bloed. …Het opent daarom de weg voor handige point of care testen … “

Abraham J. E et al. “…commerciële extractie van DNA uit speeksel is goedkoper dan uit bloed.”

And another study by Nishita, D. M. et al. rapporten ” het verkrijgen van bloedbiospecimens brengt logistieke en financiële uitdagingen met zich mee. Als gevolg daarvan speeksel biospecimen collectie wordt steeds vaker vanwege het gemak van de collectie en lagere kosten.”

over het algemeen is speeksel minder duur dan bloed voor het verzamelen van DNA wanneer rekening wordt gehouden met alle kosten in verband met de monsterverzamelingsprocedure.

feit # 8: methoden voor het verzamelen van DNA-speeksel zijn niet allemaal gelijk.

Er zijn 3 methoden voor het verzamelen van orale DNA – monsters-droge, natte en niet-invasieve procedures. Bij droge procedures moet de donor een cytobrush, buccaal uitstrijkje of een ander opvangapparaat in de mond brengen waar weefsel van het tandvlees en de wangoppervlakken wordt geschraapt. Deze methoden verzamelen voornamelijk buccale cellen en een hoog percentage bacteriën die aan het tandvlees plakken.

echter, DNA-monsters verzameld uit speeksel waarbij de donor spuugt in een opvangapparaat (Oragene) zijn heel verschillend en bieden hogere opbrengsten en DNA-kwaliteit dan andere orale DNA-monsterverzamelingsmethoden. Eén studie, getiteld New speeksel DNA Collection Method in vergelijking met Buccal Cell Collection Techniques for Epidemiological Studies, stelt:

“hele speeksel collectie leverde een gemiddelde DNA opbrengst die significant hoger was dan alle andere methoden… De mediane opbrengst … was ongeveer drie keer de mediane opbrengst van de mondspoeling, en meer dan 12 keer de mediane opbrengst voor de buccale uitstrijkjes en borstel methoden.”

Het is duidelijk dat niet alle DNA-speekselmethoden gelijk zijn, maar u kunt er zeker van zijn dat u een optie als Oragene kiest die zowel de kwaliteit als de kwantiteit van DNA optimaliseert.

conclusie

Dit zijn de 8 feiten over DNA in speeksel die we geloven dat veel mensen niet weten. We hopen dat dit helpt om veel van de verkeerde informatie die blijft circuleren over DNA uit speeksel op te helderen. Als je in het verleden geen DNA uit speeksel hebt gekozen, moet je nu vertrouwen hebben in het maken van die keuze voor projecten met genomische DNA-analyse. Tienduizenden onderzoekers en clinici over de hele wereld werken al met speeksel vanwege de hoge kwaliteit van de prestaties in combinatie met snelle en gemakkelijke verzameling en efficiënt transport. Zorg ervoor dat u evaluatie kits voor uw volgende studie hieronder aan te vragen.

Thiede, C. et al. Buccale swabs maar niet mondwater monsters kunnen worden gebruikt om pre-transplantatie DNA vingerafdrukken van ontvangers van allogene beenmergtransplantatie te verkrijgen. (2000). beenmergtransplantatie. 25(5): 575-577.

Human genomic DNA content of speeksel samples collected with the Oragene® self-collection kit, DNA Genotek white paper, PD-WP-011

Iwasiow, R. M. and Birnboim, H. C. (2006). Van troebelheid naar duidelijkheid: eenvoudige methoden om de A260/A280 Verhouding van Oragene®-gezuiverde DNA-monsters te verbeteren. DNA Genotek. MK-AN-017

DNA-opbrengst met een Oragene ® zelfverzamelingskit, DNA Genotek. PD-WP-001.

Iwasiow, R. M. and Birnboim, H. C. (2011). Langdurige stabiliteit van DNA uit speekselmonsters opgeslagen in de Oragene® self-collection kit. DNA Genotek. PD-WP-005

McLean et al, Whole-genome sequencing of 50 LRRK2 G2019S carriers discordant for Parkinson ‘ s disease,

Dodge s, Ferriera S, Philippakis A, Farjoun Y, Banks E, Barry a, Wilkinson J, Cabili M, Sutherland s, Siedzik D, De Smet T, Gabriel S. Sequencing Whole genomen with DNA Derived from speeksel. Poster session presented at: 2016 Advances in Genome Biology and Technology Meeting (AGBT); 2016 Feb 10-13; Orlando, FL.

Ambrosone C. B. et al. Het uitvoeren van moleculair epidemiologisch onderzoek in het HIPAA-Tijdperk: Een Multi-institutionele Case-Control studie van borstkanker bij Afro-Amerikaanse en Europees-Amerikaanse vrouwen. J Oncol. 2009: 1-15 (2009).

Daksis J. I. en Erikson G. H. Heteropolymeric Triplex-Based Genomic Assay® voor de detectie van pathogenen of Single-Nucleotide polymorfismen in humane Genomic Samples. PLoS ÉÉN. 2 (3): e305 (2007).

Abraham, J. E. et al. (2012). Speekselmonsters zijn een levensvatbaar alternatief voor bloedmonsters als bron van DNA voor hoge productie genotypering.

Nishita D. M. et al. Kenmerken van deelnemers aan klinische proeven en speeksel en DNA-statistieken. BMC Med Res methode. 9(71): 1-20 (2009).

Rogers N. L. et al. Nieuwe speeksel DNA collectie methode vergeleken met buccale cel collectie technieken voor epidemiologische Studies. Am J Hum Biol. 19:319–326 (2007).

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *