8 faktów większość ludzi nie wie o DNA ze śliny

od czasu uruchomienia tego bloga, the Genetic Link, w 2009 roku, opublikowaliśmy liczne artykuły, wywiady, informacje techniczne i infografiki, aby podzielić się tym, co wiemy o DNA ze śliny . Ślina jest najbardziej dostępnym bio-płynem ludzkiego ciała, ale po 7 latach nadal jesteśmy zaskoczeni, jak często słyszymy błędne postrzeganie tego solidnego i łatwego do uzyskania rodzaju próbki. Nadszedł czas, aby raz na zawsze ustalić rekord DNA ze śliny. Gotowy? Oto 8 faktów o DNA ze śliny, o których większość ludzi nie wie.

fakt # 1: DNA w ślinie pochodzi zarówno z komórek nabłonka policzkowego, jak i białych krwinek.

może cię zaskoczyć, że wiele zamieszania otacza prawdziwe źródło genomowego DNA w ślinie. Co zaskakujące, większość ludzi zakłada, że źródłem DNA w ślinie są wyłącznie komórki nabłonka policzkowego. Jednak badania pokazują, że do 74% DNA w ślinie pochodzi z białych krwinek, które są doskonałym źródłem dużych ilości wysokiej jakości genomowego DNA. Otrzymując praktycznie taką samą ilość DNA na objętość i taką samą jakość DNA jak krew, ślinę można uznać za równoważną krwi w zastosowaniach genetycznych.

fakt # 2: zdecydowana większość DNA ze śliny pochodzi od człowieka.

podczas gdy większość naukowców preferuje duże ilości DNA, postęp technologiczny na platformach niższego szczebla umożliwia teraz testowanie nawet niewielkich ilości DNA z zastrzeżeniem, że DNA jest wystarczającej jakości. Jak stwierdzono w rzeczywistości # 1, Większość DNA w ślinie pochodzi z białych krwinek. Jednak ludzka ślina zawiera również bakterie. Podczas ekstrakcji DNA ze śliny DNA bakteryjne jest odzyskiwane wraz z ludzkim DNA. W porównaniu z innymi metodami pobierania próbek doustnych, takimi jak wymazy z policzka lub płyn do płukania jamy ustnej, 2 ml próbki śliny pobranej z Oragenem daje około 11% DNA bakterii, znacznie mniej niż w przypadku płukania jamy ustnej przy 66% i cytobruszek przy ponad 88% DNA bakterii.

Jeśli używasz śliny zebranej z produktem takim jak Oragene, możesz mieć pewność, że większość DNA ze śliny jest pochodzenia ludzkiego o bardzo niskiej zawartości bakterii.

fakt # 3: DNA ze śliny ma wysoką czystość, pomimo niskiego stosunku A260/A230.

Absorbancja przy 230 służy do pomiaru różnych zanieczyszczeń, takich jak fenol i związki fenolowe, węglowodany i inne substancje organiczne. Próbki śliny zawierają dużą ilość węglowodanów (z silnie glikozylowanego białka mucyna). Podczas gdy białko jest usuwane podczas ekstrakcji, niewielkie ilości tego węglowodanu są pozostawiane. Węglowodany wchłaniają się bardzo silnie przy 230 nm, więc nawet małe ilości węglowodanów mogą znacznie nadmuchać odczyt 230 co prowadzi do słabego stosunku. Obecność tych węglowodanów nie wpływa na dalsze stosowanie, a zatem A260/A230 nie jest użyteczną metodą oceny przydatności do dalszego stosowania DNA ekstrahowanego z próbek śliny. Fenole mogą być niepokojące; jednak nie znajdują się one w odczynnikach oragene i prepIT•L2P, więc nie jest to problem dla próbek oragene/śliny.

aby dokładnie zmierzyć czystość DNA ekstrahowanego ze śliny, należy obliczyć A260/A280. Stosunek absorbancji przy 260 nm vs 280 nm jest powszechnie stosowany do oceny skażenia DNA roztworów białkowych, ponieważ białka (w szczególności aminokwasy aromatyczne) absorbują światło przy 280 nm. Podczas ekstrakcji prepIT * L2P mediana stosunku A260/A280 wynosi od 1,6 do 1,9. Współczynniki te są zazwyczaj wskazujące na próbkę DNA, która będzie dobrze działać na Twoim dalszym zastosowaniu, biorąc pod uwagę, że wszystkie inne wskaźniki kontroli jakości przechodzą (wysoka masa cząsteczkowa na żelu, dopuszczalne stężenia za pomocą fluorescencyjnej metody kwantyfikacji).

fakt # 4: ślina daje duże ilości wysokocząsteczkowego DNA.

podczas ekstrakcji DNA z próbek oragenu / śliny RNA będzie współwystępować z DNA. RNA nie wpłynie na dalsze zastosowania (w tym PCR, genotypowanie SNP, WES lub WGS) i może zostać usunięty, jednak wpłynie na ilościową ocenę DNA, jeśli będzie ona ilościowa tylko przez absorbancję. Nanodrop) mierzy się całkowitą ilość kwasów nukleinowych w próbce (RNA i DNA). Dlatego ilość DNA w próbce może być zawyżona i może skutkować zmniejszoną wydajnością z powodu niedostatecznego załadowania DNA do testu. Kwantyfikacja oparta na fluorescencji, taka jak Picogreen lub Qubit, zapewnia dokładny pomiar DNA w próbce śliny.

mediana wydajności DNA z 2 ml próbki śliny z użyciem oragenu wynosi 110 µg po oczyszczeniu zgodnie ze zoptymalizowanym protokołem Oragenu z użyciem prepIT * L2P i mierzonej metodą wysoce specyficznej fluorescencji / DNazy. Pod względem masy cząsteczkowej DNA z oragenu / śliny wynosi >23 kbp. Zarówno wydajność DNA, jak i masa cząsteczkowa pozostaną wysokiej integralności przez lata w temperaturze pokojowej, gdy zostaną zebrane w chemii stabilizacji Oragenu.

fakt # 5: ślina może niezawodnie zastąpić krew do analizy DNA.

pobieranie krwi jest często uważane za złoty standard jakości DNA i jest ugruntowaną praktyką w szpitalach, klinikach i laboratoriach na całym świecie. Jednak wiele osób nie wie, że zastąpienie krwi śliną jest sprawdzoną opcją analizy genomowego DNA.

Zestawy do zbierania śliny (Oragene) mają na celu stabilizację DNA o dużej masie cząsteczkowej poprzez hamowanie degradacji i zapobieganie rozwojowi bakterii. Większość DNA uzyskanego z Oragenu to > 23kb wielkości fragmentu, a ilość bakterii ma MINIMALNE znaczenie praktyczne, ponieważ zdecydowana większość pochodzi od człowieka (średnio tylko 11,8% bakterii).

wiele badań potwierdza DNA wyekstrahowane z próbek Oragenu/śliny w wyniku DNA o najwyższej integralności, wykonując równoważnie do krwi dla najbardziej wymagających zastosowań, w tym mikromacierzy i sekwencjonowania (celowane i cały genom).

fakt # 6: DNA ze śliny nadaje się do sekwencjonowania całego genomu (WGS).

jesteśmy zaskoczeni, że nadal słyszymy obawy o użycie śliny do sekwencjonowania i nadszedł czas, aby raz na zawsze położyć kres tym obawom. Istnieje wiele naukowych odniesień do śliny (Oragene) z powodzeniem stosowane do sekwencjonowania w małych i dużych badaniach. Na przykład dr Cory McLean z 23andMe przedstawił plakat, w którym opisał WGS 50 próbek śliny. Praca Dr McLeana skupiała się na mutacji LRRK2 G2019S w kohorcie choroby Parkinsona, zachęcam do obejrzenia jego plakatu. DNA wyekstrahowane z tych zarchiwizowanych próbek Oragenu / śliny zsekwencjonowano, przy użyciu technologii Illumina, do średniej głębokości 44,9-krotnego pokrycia i obejmowało 97,8 – 98,2% genomu. Po zidentyfikowaniu wariantów w tych próbkach Dr McLean porównał wyniki z danymi z tej samej kohorty wcześniej oznaczonymi za pomocą tablicy genotypowania i zaobserwował zgodność 99,91 – 99,97%, wskazując, że próbki oragenu/śliny zapewniają spójne wyniki na różnych platformach technologicznych. Pytanie, które wielu badaczy nadal zadaje jest: jaki wpływ ma zawartość bakterii ze śliny na sekwencjonowanie? Wyraźnie wykazaliśmy, że podczas sekwencjonowania zawartość bakterii nie ma wpływu na wywołanie wariantu.

ponadto, plakat ostatnio zaprezentowany przez Broad Institute stwierdził:

„do tej pory zsekwencjonowaliśmy ponad 1585 próbek śliny (Oragene) do 30x pokrycia za pomocą Hiseqx (Illumina)… biorąc pod uwagę to doświadczenie, jesteśmy przekonani, że sekwencjonowanie próbek pacjentów ze śliny (Oragene) może być opłacalne i przynieść wysokiej jakości wyniki badań i badań klinicznych.”

Jeśli wahałeś się użyć śliny do sekwencjonowania całego genomu, możesz być pewien, że nadszedł czas, aby spróbować.

fakt # 7: pobieranie DNA ze śliny jest tańsze niż DNA z krwi.

cena związana z pobieraniem krwi może być postrzegana jako bezpłatna dla wielu instytucji, które ustanowiły laboratoria pobierania krwi / centra serwisowe; jednak istnieją realne koszty pobierania próbek nawet w tych środowiskach. Flebotomiści, zaopatrzenie medyczne i wymagania dotyczące wysyłki (suchy lód, pojemniki i dostawa na noc) dodają szacunkowo 40 USD za próbkę, nie wliczając przechowywania w zamrażarce. DNA ze śliny, zebrane z produktem takim jak Oragen, w porównaniu, jest w różnych formatach o różnej wydajności i zdolności stabilności, które kosztują od 48% do 80% mniej. Więcej oszczędności wprowadza się, ponieważ produkty Oragene umożliwiają odbiór w domu, standardową wysyłkę za pośrednictwem zwykłej poczty w temperaturze pokojowej i zerowe chłodzenie.

Daksis, J. I. et al. stwierdza: „pozyskanie wysokiej jakości DNA do testu molekularnego z próbek doustnych oferuje wyraźne korzyści w zakresie kosztów, obsługi, przechowywania i wysyłki w porównaniu z pozyskiwaniem próbek z krwi. … Otwiera zatem drogę do wygodnego badania punktu opieki … ”

Abraham J. E et al. kontynuuje ” … komercyjna ekstrakcja DNA ze śliny jest tańsza niż z krwi.”

and another study by Nishita, D. M. et al. raporty ” uzyskanie biospecymens krwi stanowi wyzwania logistyczne i finansowe. W rezultacie, ze względu na łatwość zbierania i niższe koszty, kolekcja biospecimen śliny staje się coraz częstsza.”

ogólnie rzecz biorąc, ślina jest tańsza niż krew do pobrania DNA, biorąc pod uwagę wszystkie koszty związane z procedurą pobierania próbek.

fakt # 8: metody pobierania próbek śliny DNA nie wszystkie są sobie równe.

Istnieją 3 metody pobierania doustnych próbek DNA – procedury suche, mokre i nieinwazyjne. Suche procedury wymagają dawcy wstawić cytobrush, wymaz z policzka lub innego urządzenia do zbierania w jamie ustnej, gdzie tkanka jest zeskrobana z powierzchni dziąseł i policzków. Metody te zbierają przede wszystkim komórki policzkowe i wysoki odsetek bakterii, które przyklejają się do linii dziąseł.

jednak próbki DNA pobrane ze śliny, gdzie dawca pluje do urządzenia do pobierania (Oragene) są zupełnie inne i oferują wyższą wydajność i jakość DNA niż inne doustne metody pobierania próbek DNA. W jednym z badań, zatytułowanym New Saliva DNA Collection Method Compared to Polical Cell Collection Techniques for Epidemiological Studies, stwierdza się:

„whole-saliva collection provided an average DNA performance that was significantly greater than all other methods… Mediana wydajności … wynosiła około trzy razy mediana wydajności płukania jamy ustnej i ponad 12 razy mediana wydajności wymazu z policzka i szczoteczki.”

oczywiste jest, że nie wszystkie metody śliny DNA są sobie równe, ale możesz być pewien, wybierając opcję taką jak Oragene, która optymalizuje zarówno jakość, jak i ilość DNA.

wnioski

oto 8 faktów dotyczących DNA w ślinie, o których, jak sądzimy, wielu ludzi nie wie. Mamy nadzieję, że pomoże to wyjaśnić wiele dezinformacji, które nadal krążą na temat DNA ze śliny. Jeśli nie wybrałeś DNA ze śliny w przeszłości, powinieneś teraz czuć się pewnie w podejmowaniu tego wyboru dla wszelkich projektów obejmujących analizę genomowego DNA. Dziesiątki tysięcy naukowców i klinicystów na całym świecie już pracują ze śliną ze względu na jej wysoką jakość w połączeniu z szybkim i łatwym pobieraniem i efektywnym transportem. Pamiętaj, aby poprosić o zestawy ewaluacyjne do następnego badania poniżej.

Wymazy z policzka, ale nie próbki płynu do płukania jamy ustnej, można wykorzystać do uzyskania odcisków DNA przed przeszczepem od biorców allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego. (2000). Przeszczep Szpiku Kostnego. 25(5): 575-577.

zawartość ludzkiego genomowego DNA próbek śliny zebranych za pomocą zestawu do samodzielnej kolekcji ORAGENE®, DNA Genotek white paper, PD-WP-011

Iwasiow, R. M. and Birnboim, H. C. (2006). Od mętności do przejrzystości: proste metody poprawy stosunku A260/A280 oczyszczonych próbek DNA Oragene®. Genotek DNA. MK-AN-017

wydajność DNA z zestawem oragene® self-collection, DNA Genotek. PD-WP-001.

Iwasiow, R. M. and Birnboim, H. C. (2011). Długotrwała stabilność DNA z próbek śliny przechowywanych w zestawie oragene® self-collection. Genotek DNA. PD-WP-005

McLean et al, sekwencjonowanie całego genomu 50 nośników lrrk2 G2019S niezgodnych z chorobą Parkinsona,

Dodge s, Ferriera s, Philippakis a, Farjoun Y, Banks e, Barry a, Wilkinson J, Cabili m, Sutherland S, Siedzik d, De Smet T, Gabriel S. sekwencjonowanie całych genomów DNA pochodzących ze śliny. Sesja plakatowa prezentowana na: 2016 Advances in Genome Biology and Technology Meeting (AGBT); 2016 Feb 10-13; Orlando, FL.

Ambrosone C. B. et al. Prowadzenie molekularnych badań epidemiologicznych w epoce HIPAA: Multi-Institutional Case-Control Study of Breast Cancer in African-American and European-American Women. J Oncol. 2009: 1-15 (2009).

Daksis J. I. and Erikson G. H. Heteropolimeric Triplex-Based Genomic Assay® to Detect patogeny or Single-Nucleotide Polymorphisms in Human Genomic Samples. PLoS 1. 2(3): e305 (2007).

(2012). Próbki śliny są realną alternatywą dla próbek krwi jako źródło DNA dla wysokiej przepustowości genotypowania.

Nishita D. M. et al. Charakterystyka uczestników badania klinicznego oraz metryki śliny i DNA. Metoda BMC Med Res. 9(71): 1-20 (2009).

Rogers N. L. et al. Nowa metoda pobierania DNA śliny w porównaniu z technikami pobierania komórek policzkowych w badaniach epidemiologicznych. Am J Hum Biol. 19:319–326 (2007).

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *