8 fapte majoritatea oamenilor nu știu despre ADN-ul din salivă

de la lansarea acestui blog, the Genetic Link, în 2009, am publicat numeroase articole, interviuri, informații tehnice și infografice pentru a împărtăși ceea ce știm despre ADN-ul din salivă. Saliva este cel mai accesibil bio-fluid al corpului uman, dar, după 7 ani, continuăm să fim surprinși de cât de des auzim percepții greșite despre acest tip de probă robust și ușor de accesat. Este timpul pentru a stabili recordul direct pe ADN-ul din saliva o dată pentru totdeauna. Ești gata? Iată 8 fapte despre ADN-ul din salivă pe care majoritatea oamenilor nu le cunosc.

fapt # 1: ADN-ul din salivă este derivat atât din celulele epiteliale bucale, cât și din celulele albe din sânge.

s-ar putea să vă surprindă să știți că multă confuzie înconjoară adevărata sursă de ADN genomic din salivă. În mod surprinzător, majoritatea oamenilor presupun că sursa ADN-ului din salivă este strict celulele epiteliale bucale. Cu toate acestea, studiile arată că până la 74% din ADN-ul din salivă provine din celulele albe din sânge, care sunt o sursă excelentă de cantități mari de ADN genomic de înaltă calitate. Producând practic aceeași cantitate de ADN pe volum și aceeași calitate a ADN-ului ca sângele, saliva poate fi considerată echivalentă cu sângele pentru aplicații genetice.

fapt # 2: marea majoritate a ADN-ului din salivă este de origine umană.

în timp ce majoritatea oamenilor de știință preferă cantități mari de ADN, progresele tehnologice în platformele din aval permit acum testarea chiar și a unor cantități mici de ADN, cu avertismentul că ADN-ul este de o calitate suficientă. 1, majoritatea ADN-ului din salivă provine din celulele albe din sânge. Cu toate acestea, saliva umană conține și bacterii. La extragerea ADN-ului din salivă, ADN-ul bacterian este recuperat împreună cu ADN-ul uman. În comparație cu alte metode de prelevare orală, cum ar fi tampoane bucale sau apă de gură, o probă de salivă de 2 ml colectată cu Oragen produce aproximativ 11% ADN bacterian, substanțial mai mică decât apa de gură la 66% și citobrushes la peste 88% ADN bacterian.

dacă utilizați saliva colectată cu un produs precum Oragene, puteți fi siguri că majoritatea ADN-ului din salivă este de origine umană cu conținut bacterian foarte scăzut.

fapt # 3: ADN-ul din salivă este de înaltă puritate, în ciuda raporturilor scăzute A260 / A230.

absorbanța la 230 este utilizată pentru a măsura diferiți contaminanți, cum ar fi fenolul și compușii fenolici, carbohidrații și alte substanțe organice. Probele de salivă conțin o cantitate mare de carbohidrați (din mucina proteică puternic glicozilată). În timp ce proteina este îndepărtată în timpul extracției, cantități mici din acest carbohidrat sunt lăsate în urmă. Carbohidrații absorb foarte puternic la 230nm, astfel încât chiar și cantități mici de carbohidrați pot umfla foarte mult citirea 230 care duce la un raport slab. Prezența acestor carbohidrați nu afectează aplicarea în aval și, prin urmare, A260/A230 nu este o metodă utilă pentru a evalua adecvarea pentru utilizarea în aval a ADN-ului extras din probele de salivă. Fenolicii pot fi îngrijorători; cu toate acestea, acestea nu se află în reactivii Oragene și prepIT•L2P, deci aceasta nu este o problemă pentru probele de oragene/salivă.

pentru a măsura cu exactitate puritatea ADN-ului extras din salivă, trebuie calculat A260/A280. Raportul de absorbție la 260 nm față de 280 nm este utilizat în mod obișnuit pentru a evalua contaminarea ADN a soluțiilor proteice, deoarece proteinele (în special aminoacizii aromatici) absorb lumina la 280 nm. La extragerea cu prepIT * L2P raportul median A260 / A280 este cuprins între 1,6-1,9. Aceste rapoarte sunt de obicei indicative pentru o probă de ADN care va funcționa bine în aplicația dvs. din aval, având în vedere că toate celelalte valori QC trec (greutate moleculară mare pe gel, concentrații acceptabile prin metoda de cuantificare bazată pe fluorescență).

fapt # 4: Saliva produce o cantitate mare de ADN cu greutate moleculară mare.

la extragerea ADN-ului din probele de Oragen / salivă, ARN-ul se va co-purifica cu ADN-ul. ARN – ul nu va afecta aplicațiile dvs. din aval (inclusiv PCR, genotiparea SNP, WES sau WGS) și poate fi eliminat, totuși va afecta cuantificarea ADN-ului Dacă se cuantifică numai prin absorbție. Când cuantificați prin absorbanță (cum ar fi Nanodrop), măsurați cantitatea totală de acizi nucleici dintr-o probă (ARN și ADN). Prin urmare, cantitatea de ADN dintr-o probă ar putea fi supraestimată și ar putea duce la o performanță redusă din cauza subîncărcării ADN-ului în testul dvs. Cuantificarea bazată pe fluorescență, cum ar fi Picogreen sau Qubit, oferă o măsurare exactă a ADN-ului într-o probă de salivă.

randamentul median al ADN-ului dintr-o probă de salivă de 2 ml utilizând Oragen este de 110 hectog atunci când este purificat conform protocolului Oragen optimizat utilizând prepIT•L2P și măsurat prin metoda fluorescenței / Dnazei foarte specifice. În ceea ce privește greutatea moleculară, ADN-ul din Oragene/salivă este >23 kbp în dimensiune. Atât randamentul ADN, cât și greutatea moleculară vor rămâne de integritate ridicată ani de zile la temperatura camerei atunci când sunt colectate în chimia stabilizării Oragene.

fapt # 5: Saliva poate înlocui în mod fiabil sângele pentru analiza ADN-ului.

recoltarea sângelui este adesea considerată standardul de aur pentru calitatea ADN-ului și este o practică stabilită în spitale, clinici și laboratoare din întreaga lume. Cu toate acestea, mulți oameni nu știu că înlocuirea sângelui cu saliva este o opțiune dovedită pentru analiza ADN-ului genomic.trusele de colectare a salivei (Oragene) sunt concepute pentru a stabiliza ADN-ul cu greutate moleculară mare prin inhibarea degradării și prevenirea creșterii bacteriene. Majoritatea ADN-ului obținut cu Oragene este > 23kb în dimensiunea fragmentului, iar cantitatea de bacterii are o semnificație practică minimă, deoarece marea majoritate este de origine umană (în medie doar 11,8% bacterii).

Mai multe studii confirmă că ADN-ul extras din probele de Oragen/salivă are ca rezultat ADN de cea mai mare integritate, performând echivalent cu sângele pentru cele mai solicitante aplicații, inclusiv microarrays și secvențiere (genom vizat și întreg).

fapt # 6: ADN-ul din salivă este potrivit pentru secvențierea întregului genom (WGS).

suntem surprinși că continuăm să auzim îngrijorări cu privire la utilizarea salivei pentru secvențiere și este timpul să punem aceste temeri să se odihnească o dată pentru totdeauna. Există multe referințe științifice pentru salivă (Oragene) fiind utilizat cu succes pentru secvențiere atât în studii mici, cât și în studii mari. De exemplu, Dr.Cory McLean de la 23andMe a prezentat un poster în care a descris WGS de 50 de probe de salivă. Munca Dr. McLean s-a concentrat pe mutația LRRK2 G2019S într-o cohortă a bolii Parkinson, vă încurajez să aruncați o privire la afișul său. ADN – ul extras din aceste probe arhivate de oragen/salivă a fost secvențiat, folosind tehnologia Illumina, la o adâncime mediană de acoperire de 44,9 ori și a acoperit 97,8-98,2% din genom. După identificarea variantelor din aceste probe, Dr. McLean a comparat rezultatele cu datele din aceeași cohortă determinată anterior folosind o matrice de genotipare și a observat o concordanță de 99,91 – 99,97%, indicând faptul că probele de Oragen/salivă oferă rezultate consistente pe diferite platforme tehnologice. Întrebarea pe care mulți cercetători continuă să o pună este: ce impact are conținutul bacterian din salivă asupra secvențierii? Am demonstrat clar că, atunci când se efectuează secvențierea, conținutul bacterian nu are niciun impact asupra apelării variantelor.

în plus, un poster prezentat recent de Institutul Broad a declarat:

„până în prezent, am secvențiat peste 1585 de probe de salivă (Oragene) la o acoperire de 30x folosind HiSeqX (Illumina)… având în vedere această experiență, suntem încrezători că secvențierea probelor de pacienți din saliva (Oragene) poate fi rentabilă și poate produce rezultate de înaltă calitate pentru cercetare și studii clinice.”

Dacă ați ezitat să utilizați saliva pentru secvențierea întregului genom, puteți fi siguri că acum este timpul să încercați.

fapt # 7: colectarea ADN-ului din salivă este mai puțin costisitoare decât ADN-ul din sânge.

prețul asociat colectării de sânge poate fi perceput ca fiind gratuit pentru multe instituții care au înființat laboratoare de colectare a sângelui/centre de servicii; cu toate acestea, există costuri reale pentru colectarea probelor chiar și în aceste medii. Flebotomiștii, materialele medicale și cerințele de expediere (gheață uscată, containere și livrare peste noapte) adaugă aproximativ 40 USD pe eșantion, fără a include depozitarea congelatorului. ADN – ul din salivă, colectat cu un produs precum Oragene, în comparație, vine într-o varietate de formate cu capacități de randament și stabilitate diferite, care costă între 48% – 80% mai puțin. Sunt introduse mai multe economii, deoarece produsele Oragene permit colectarea la domiciliu, transportul standard prin poștă obișnuită la temperatura camerei și refrigerarea zero.

Daksis, J. I. și colab. „achiziționarea de ADN de înaltă calitate pentru analiza moleculară din probele orale oferă avantaje clare în ceea ce privește costul, manipularea, stocarea și transportul în comparație cu achiziționarea de probe din sânge. …Prin urmare, deschide calea pentru un punct convenabil de testare a îngrijirii … „

Abraham J. E și colab. continuă „… extracția comercială a ADN-ului din salivă este mai ieftină decât din sânge.”

și un alt studiu realizat de Nishita, D. M. și colab. rapoarte ” obținerea biospecimens de sânge prezintă provocări logistice și financiare. Ca urmare, colectarea biospecimenului saliva devine din ce în ce mai frecventă din cauza ușurinței de colectare și a costurilor mai mici.”

În general, saliva este mai puțin costisitoare decât sângele pentru colectarea ADN-ului atunci când se iau în considerare toate costurile asociate procedurii de colectare a probelor.

fapt # 8: metodele de colectare a probelor de salivă ADN nu sunt toate egale.

există 3 metode de colectare a probelor de ADN oral – proceduri uscate, umede și neinvazive. Procedurile uscate necesită donatorului să introducă o citobrush, tampon bucal sau alt dispozitiv de colectare în gură, unde țesutul este răzuit de pe gingie și suprafețele obrazului. Aceste metode colectează în primul rând celulele bucale și o proporție mare de bacterii care se lipesc de gingie.

cu toate acestea, probele de ADN colectate din saliva în care donatorul scuipă într-un dispozitiv de colectare (Oragene) sunt destul de diferite și oferă randamente mai mari și o calitate a ADN-ului decât alte metode orale de colectare a probelor de ADN. Un studiu, intitulat noua metodă de colectare a ADN-ului salivei comparativ cu tehnicile de colectare a celulelor bucale pentru studii epidemiologice, afirmă:

„colecția de salivă integrală a oferit un randament mediu de ADN semnificativ mai mare decât toate celelalte metode… Randamentul Median … a fost de aproximativ trei ori randamentul median al clătirii orale și de peste 12 ori randamentul median pentru metodele de tampon bucal și perie.”

este clar că nu toate metodele de salivă ADN sunt egale, dar puteți avea încredere atunci când alegeți o opțiune precum Oragene care optimizează atât calitatea, cât și cantitatea de ADN.

concluzie

acestea sunt cele 8 fapte despre ADN-ul din salivă pe care credem că mulți oameni nu le cunosc. Sperăm că acest lucru ajută la clarificarea unei mari părți din dezinformarea care continuă să circule despre ADN-ul din salivă. Dacă nu ați ales ADN din salivă în trecut, acum ar trebui să vă simțiți încrezători în a face această alegere pentru orice proiecte care implică analiza ADN genomică. Zeci de mii de cercetători și clinicieni din întreaga lume lucrează deja cu saliva datorită performanțelor sale de înaltă calitate, împreună cu colectarea rapidă și ușoară și transportul eficient. Asigurați-vă că solicitați kituri de evaluare pentru următorul studiu de mai jos.

Thiede, C. și colab. Tampoanele bucale, dar nu probele de apă de gură, pot fi utilizate pentru a obține amprentele ADN pre-transplant de la destinatarii transplantului de măduvă osoasă alogenă. (2000). Transplantul De Măduvă Osoasă. 25(5): 575-577.

conținutul de ADN genomic uman al probelor de salivă colectate cu kitul de auto-colectare Oragene, ADN Genotek white paper, PD-WP-011

Iwasiow, R. M. și Birnboim, H. C. (2006). De la turbiditate la claritate: metode Simple de îmbunătățire a raportului A260 / A280 al probelor de ADN purificate oragene de la oragene. ADN Genotek. MK-AN-017

randament ADN cu un kit de auto-colectare oragene, ADN Genotek. PD-WP-001.

Iwasiow, R. M. și Birnboim, H. C. (2011). Stabilitatea pe termen lung a ADN-ului din probele de salivă stocate în kitul de auto-colectare Oragene. ADN Genotek. PD-WP-005

McLean și colab., secvențierea întregului genom a 50 de purtători LRRK2 G2019S discordanți pentru boala Parkinson,

Dodge s, Ferriera s, Philippakis a, Farjoun Y, Banks e, Barry a, Wilkinson J, Cabili M, Sutherland s, Siedzik D, De Smet T, Gabriel S. secvențierea Genomurilor întregi cu ADN derivat din salivă. Sesiunea de postere prezentată la: 2016 Advances in Genome Biology and Technology Meeting (AGBT); 2016 10-13 februarie; Orlando, FL.

Ambrosone C. B. și colab. Efectuarea cercetărilor epidemiologice moleculare în epoca HIPAA: Un studiu de caz-Control Multi-instituțional al cancerului de sân la femeile afro-americane și europene-americane. J Oncol. 2009: 1-15 (2009).

Daksis J. I. și Erikson G. H. heteropolimeric Triplex-test Genomic pe bază de Ecuator pentru a detecta agenți patogeni sau polimorfisme Mononucleotidice în probele genomice umane. PLoS unu. 2(3): e305 (2007).

Abraham, J. E. și colab. (2012). Probele de salivă sunt o alternativă viabilă la probele de sânge ca sursă de ADN pentru genotiparea cu randament ridicat.

Nishita D. M. și colab. Caracteristicile participanților la studiul clinic și valorile salivei și ADN-ului. Metoda BMC Med Res. 9(71): 1-20 (2009).

Rogers N. L. și colab. Noua metodă de colectare a ADN-ului salivei în comparație cu tehnicile de colectare a celulelor bucale pentru studii epidemiologice. Sunt Jum Biol. 19:319–326 (2007).

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *